张卫红¹，龚杰²，董晓雯³，马变变³

(1. 太和康美(北京)中医研究院有限公司，北京 102401；

2.上海遇鑫生物科技有限公司，上海，201499

3. 北京三立慧评化妆品科技有限公司，北京 102401；)

摘要：目的 研究苦参提取物的美白及抗氧化功效。方法 采用50%丁二醇水溶液热浸法从干燥的苦参根中分离提取苦参提取物。采用NaNO₂-Al(NO₃)₃比色法、HPLC测定活性成分黄酮、苦参碱和氧化苦参碱的含量。通过酪氨酸酶活性抑制试验、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除试验评估其美白、抗氧化活性。结果 结果表明，苦参提取物总黄酮含量为17.2mg/g，苦参碱及氧化苦参碱含量分别为0.834mg/g、13.6mg/g；苦参提取物对酪氨酸酶活性抑制率的IC₅₀值为0.31%（质量分数），对DPPH自由基清除率的IC₅₀值为0.19%（质量分数）。结论：苦参提取物应用于化妆品中，预期可发挥美白及抗氧化功效。

关键词：苦参提取物，美白，抗氧化

苦参，别名干人参，为豆科植物，主要含有苦参碱、氧化苦参碱等多种生物碱及黄酮类成分，具有清热燥湿，驱虫利尿等功效，可用于用于热痢、湿疹、皮肤瘙痒等方面^[1]。研究表明，苦参碱与氧化苦参碱是苦参中主要标志物，具有抗病毒、抗炎、镇静、镇痛等临床上的作用^[2,3]。黄酮类成分作为苦参中重要功效成分，具有抗炎、抗肿瘤和抗菌等作用，且黄酮类化合物对细菌和真菌均有抑制作用^[4]。

本研究以苦参根为原料，选用化妆品常用溶剂丁二醇来提取分离得到苦参取物，通过对苦参提取物活性物加以测定，采用抑制酪氨酸酶活性及DPPH自由基清除试验，进行体外功效研究，使苦参更科学、明确的应用于化妆品功效原料添加剂。

1 材料

1.1原料与试剂

苦参根，购自北京同仁堂航天桥药店，产地内蒙。

无水乙醇，购于国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸酶、DPPH购于Sigma-Aldrich（中国）；NaNO_2、Al(NO₃)₃•9H₂O、NaOH购于西陇化工股份有限公司；芦丁标准品，东京化成工业株式会社；抗坏血酸（简称：Vc），拜尔迪生物有限公司；乙腈、乙醇为色谱纯，购于Fisher。其他试剂为分析纯。

1.2主要仪器

Miltiskan GO酶标仪，Thermo Fisher；漩涡混合器，大龙兴创试验仪器有限公司；电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；高效液相色谱仪附二极管阵列检测器，安捷伦科技有限公司；高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；分析天平，赛多利斯，FD-1D-50冷冻干燥机，北京华圣科仪实验设备有限公司。

2 试验方法

2.1苦参提取物制备

将苦参根碎粉，过40目筛，准确称取一定量的苦参根，按0.10g·mL^-1的生药量提取，加入50%丁二醇水溶液（质量分数），70-75℃热提90min，过滤，即得苦参提取物，4℃冷藏备用。

2.2活性物含量检测

2.2.1黄酮含量

测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃比色法^[5]测定。

①溶液配制：

5%NaNO₂溶液：称取NaNO₂ 5.0 g，溶解于100mL去离子水中，置于棕色瓶；10% Al(NO₃)₃溶液：称取Al(NO₃)₃•9H₂O 17.6 g，溶解于100mL去离子水中，置于棕色瓶；1.0mol·L^-1 NaOH溶液：称取4.0 g NaOH固体，加去离子水100mL，混匀备用。

芦丁标准溶液：称取芦丁标准品（C₂₇H₃₀O₁₆·3H₂0，分子量664.56.25）65.2 mg，用30%乙醇溶解，70℃水浴助溶，放冷并完全转入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，摇匀得浓度为0.599 mg/mL芦丁标准溶液，备用。

②确定标准曲线：

取7组50mL容量瓶，分别加入0（空白），1.00、2.00、3.00、4.50、6.00和8.00mL芦丁标准溶液，用30%乙醇补至约25 mL，分别加入5% NaNO₂溶液1.40mL摇匀，放置5min后分别加入10% Al(NO₃)₃溶液 1.40mL，摇匀，6 min后再分别加入1.0mol·L^-1 NaOH溶液10.00 mL，混匀，用30%乙醇稀释至刻度。20min后于波长510nm处以空白试液做参比测定吸光值。以芦丁标准溶液的理论浓度为纵坐标，平均吸光值为横坐标，制定标准曲线，得出标准曲线的回归方程：Y=AX+B [式中Y为芦丁浓度（mg/mL），X为吸光值]。

③试样测定：

试样配制：准确称取1.0 g苦参提取物试样，用10 mL 30%乙醇稀释，制备成待测样品。

根据标准曲线的方法测量样品的吸光度，每个样品3个平行，取三次测定的算术平均值，再按标准曲线计算出苦参提取物的黄酮含量。

2.2.2苦参碱及氧化苦参碱含量

含量测定：HPLC法；

①色谱条件^[6]

色谱柱：Agilent Eclipse plus-C18 (150mm×4.6,5μm)，流动相A：3%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；流动相C：无水乙醇；流速：0.50 mL/min，进样量：5 µL，柱温：30 ℃，检测波长：220 nm。

②标准曲线的建立

精密称取苦参碱标准品20mg、氧化苦参碱标准品50mg，精密称定，加乙腈-无水乙醇（80：20）混合溶液，定容至50mL容量瓶中，作为标准品溶液（苦参碱：0.2mg·mL^-1、0.5mg·mL^-1）。分别移取标准品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL置于25 mL容量瓶中，乙腈-无水乙醇（80：20）混合溶液定容，用0.45 µm滤膜过滤备用；按2.2.2中的色谱条件进行检测标准品含量测定。以质量浓度（c，µg·mL^-1）为横坐标，以峰面积（x）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

③试样含量测定

准确称取苦参提取物25 mg，乙腈-无水乙醇（80：20）混合溶液定容100 mL，按2.2.2中的色谱条件进行检测，回归方程求得苦参碱及氧化苦参碱含量；并计算各自含量（y，mg/g）。

式中：y—苦参碱及氧化苦参碱得率，mg/g；c—苦参碱或氧化苦参碱的质量浓度，µg·mL^-1；v—提取液体积，mL；n—稀释倍数；m—苦参提取物质量，g。

2.3体外生化试验

2.3.1 酪氨酸酶抑制试验

皮肤色素的形成是由于表皮中黑色素的积累造成的^[7]，黑色素合成过量，会造成皮肤色素沉积，形成色斑，导致肌肤黯沉。一般情况下，酪氨酸酶活性越高，黑色素合成越多。可通过抑制酪氨酸酶活性，来控制黑色素的合成速率^[8]。通过酪氨酸酶活性抑制率，评估物质应用于化妆品中的美白功效，实验反应体系如表1所示。

按照表1的顺序，加样结束后，在25℃下孵育30min，在475nm处测定吸光值。

表1 酪氨酸酶反应体系

酪氨酸酶抑制率，计算公式见2-2：

式（2-2）中：A、B、C、D分别为A、B、C、D四组反应管反应结束后在475nm处的吸光值。

2.3.2 DPPH自由基清除试验

DPPH是一种很稳定的“氮中心”的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用，具有较强的稳定性，具有典型的紫色，当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成的产物无色，使溶液的典型紫色变浅，其褪色程度与配对电子数成化学计量关系^[9-10]。通过DPPH自由基的清除能力反映了物质的抗氧化活性，清除率越大表明抗氧化活性越强。

通过构建DPPH自由基清除试验体系，评估苦参提取物对DPPH自由基的清除能力，试验反应体系如表2所示。

表2 DPPH自由基清除试验反应体系

按照表2的顺序，加样结束后，25℃水浴下恒温反应20min，在517nm处测各管吸光值。清除率计算公式为：

式（2-3）中，A、B、C分别为A、B、C三组反应管反应结束后在517nm处的吸光值。

3 结果与分析

3.1活性物测定结果

检测结果：50%丁二醇水溶液提取的苦参提取物样液中，黄酮含量为17.2mg/g，苦参碱及氧化苦参碱含量分别为0.834mg/g、13.6mg/g。说明苦参富含多种活性成分，为其在化妆品护肤功效应用提供一定的物质基础。

3.2酪氨酸酶抑制能力

由图1可知，苦参提取物可以有效抑制酪氨酸酶活性，随着苦参提取物受试浓度的增加，酪氨酸酶活性抑制率逐渐增加，其抑制率与受试浓度呈现出良好的量效关系；苦参提取物对酪氨酸酶活性抑制率IC₅₀值约为0.31%（质量分数），表明苦参提取物具有潜在的美白功效。

图1 酪氨酸酶抑制能力

3.3 DPPH清除自由基能力

不同浓度的苦参提取物对DPPH自由基的清除率结果，见图2。由图2可知，苦参提取物具有优异的清除DPPH自由基活性，且随着受试浓度的增加，清除率逐渐增大，且呈现出良好的量效关系。苦参提取物对DPPH自由基清除率IC₅₀值为0.19%（质量分数），说明了苦参提取物具有良好的抗氧化功效。

图2 DPPH自由基清除能力

4 结论

苦参根提取物富含黄酮、苦参碱及氧化苦参碱等生物活性成分，为其护肤应用提供了物质基础。通过抑制酪氨酸酶试验及DPPH自由基清除率试验，证实了苦参提取物对酪氨酸酶活性具有良好的抑制作用，在清除DPPH自由基活性方面作用显著，且随着苦参提取物受试浓度的增加，呈现良好的量效关系。因此，苦参提取物应用于护肤中，预期具有良好的美白、抗氧化功效。

参考文献

[1] 姚梅芬, 张思巨, 李琳, 等. 苦参中黄酮类成分及其药理作用研究现状[J]. 中国中医药信息杂志, 2013, 20(3):110-112.

[2] 张凤玲, 唐永, 张景梅. 苦参碱、氧化苦参碱的药理作用及其制剂的研究进展[J]. 中医学报, 2004, 19(3):84-86.

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[4] 王勇, 杨宁, 晋春燕, 等. 苦参提取物对植物病原真菌抑制作用及提取工艺条件优化[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2017, (02):110-113.

[5] 张红城, 董捷, 李慧,等. 六种蜂花粉多酚和黄酮类物质含量测定及抗氧化性的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(9):500-504.

[6] 卫生部药典委员会.中国药典（2015版一部）[S]. 中国医药科技出版社,2015:202.

[7] Rafiee M, Javaheri M. A theoretical study of benzaldehyde derivatives as tyrosinase inhibitors using Ab initio calculated NQCC parameters[J]. Molecular Biology Research Communications, 2015, 4(3):151-159.

[8] Maeda K, Fukuda M. In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J SocCosmetChem 1991, 42:361-368.

[9] Omp S, Tejk B. DPPH antioxidant assay revisited[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4):1202-1205.

[10] 李铉军, 崔胜云. 抗坏血酸清除DPPH自由基的作用机理[J]. 食品科学, 2011, 32(1):86-90.

第一作者：张卫红

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