张卫红¹，龚杰²，董晓雯³，马变变³

(1. 太和康美(北京)中医研究院有限公司，北京 102401；

2.上海遇鑫生物科技有限公司，上海，201499

3. 北京三立慧评化妆品科技有限公司，北京 102401；)

摘要：目的 研究苦参提取物的美白及抗氧化功效。方法 采用50%丁二醇水溶液热浸法从干燥的苦参根中分离提取苦参提取物。采用NaNO₂-Al(NO₃)₃比色法、HPLC测定活性成分黄酮、苦参碱和氧化苦参碱的含量。通过酪氨酸酶活性抑制试验、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除试验评估其美白、抗氧化活性。结果 结果表明，苦参提取物总黄酮含量为17.2mg/g，苦参碱及氧化苦参碱含量分别为0.834mg/g、13.6mg/g；苦参提取物对酪氨酸酶活性抑制率的IC₅₀值为0.31%（质量分数），对DPPH自由基清除率的IC₅₀值为0.19%（质量分数）。结论：苦参提取物应用于化妆品中，预期可发挥美白及抗氧化功效。

关键词：苦参提取物，美白，抗氧化

苦参，别名干人参，为豆科植物，主要含有苦参碱、氧化苦参碱等多种生物碱及黄酮类成分，具有清热燥湿，驱虫利尿等功效，可用于用于热痢、湿疹、皮肤瘙痒等方面^[1]。研究表明，苦参碱与氧化苦参碱是苦参中主要标志物，具有抗病毒、抗炎、镇静、镇痛等临床上的作用^[2,3]。黄酮类成分作为苦参中重要功效成分，具有抗炎、抗肿瘤和抗菌等作用，且黄酮类化合物对细菌和真菌均有抑制作用^[4]。

本研究以苦参根为原料，选用化妆品常用溶剂丁二醇来提取分离得到苦参取物，通过对苦参提取物活性物加以测定，采用抑制酪氨酸酶活性及DPPH自由基清除试验，进行体外功效研究，使苦参更科学、明确的应用于化妆品功效原料添加剂。

1 材料

1.1原料与试剂

苦参根，购自北京同仁堂航天桥药店，产地内蒙。

无水乙醇，购于国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸酶、DPPH购于Sigma-Aldrich（中国）；NaNO_2、Al(NO₃)₃•9H₂O、NaOH购于西陇化工股份有限公司；芦丁标准品，东京化成工业株式会社；抗坏血酸（简称：Vc），拜尔迪生物有限公司；乙腈、乙醇为色谱纯，购于Fisher。其他试剂为分析纯。

1.2主要仪器

Miltiskan GO酶标仪，Thermo Fisher；漩涡混合器，大龙兴创试验仪器有限公司；电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；高效液相色谱仪附二极管阵列检测器，安捷伦科技有限公司；高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；分析天平，赛多利斯，FD-1D-50冷冻干燥机，北京华圣科仪实验设备有限公司。

2 试验方法

2.1苦参提取物制备

将苦参根碎粉，过40目筛，准确称取一定量的苦参根，按0.10g·mL^-1的生药量提取，加入50%丁二醇水溶液（质量分数），70-75℃热提90min，过滤，即得苦参提取物，4℃冷藏备用。

2.2活性物含量检测

2.2.1黄酮含量

测定方法：采用NaNO₂-Al(NO₃)₃比色法^[5]测定。

①溶液配制：

5%NaNO₂溶液：称取NaNO₂ 5.0 g，溶解于100mL去离子水中，置于棕色瓶；10% Al(NO₃)₃溶液：称取Al(NO₃)₃•9H₂O 17.6 g，溶解于100mL去离子水中，置于棕色瓶；1.0mol·L^-1 NaOH溶液：称取4.0 g NaOH固体，加去离子水100mL，混匀备用。

芦丁标准溶液：称取芦丁标准品（C₂₇H₃₀O₁₆·3H₂0，分子量664.56.25）65.2 mg，用30%乙醇溶解，70℃水浴助溶，放冷并完全转入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，摇匀得浓度为0.599 mg/mL芦丁标准溶液，备用。

②确定标准曲线：

取7组50mL容量瓶，分别加入0（空白），1.00、2.00、3.00、4.50、6.00和8.00mL芦丁标准溶液，用30%乙醇补至约25 mL，分别加入5% NaNO₂溶液1.40mL摇匀，放置5min后分别加入10% Al(NO₃)₃溶液 1.40mL，摇匀，6 min后再分别加入1.0mol·L^-1 NaOH溶液10.00 mL，混匀，用30%乙醇稀释至刻度。20min后于波长510nm处以空白试液做参比测定吸光值。以芦丁标准溶液的理论浓度为纵坐标，平均吸光值为横坐标，制定标准曲线，得出标准曲线的回归方程：Y=AX+B [式中Y为芦丁浓度（mg/mL），X为吸光值]。

③试样测定：

试样配制：准确称取1.0 g苦参提取物试样，用10 mL 30%乙醇稀释，制备成待测样品。

根据标准曲线的方法测量样品的吸光度，每个样品3个平行，取三次测定的算术平均值，再按标准曲线计算出苦参提取物的黄酮含量。

2.2.2苦参碱及氧化苦参碱含量

含量测定：HPLC法；

①色谱条件^[6]

色谱柱：Agilent Eclipse plus-C18 (150mm×4.6,5μm)，流动相A：3%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；流动相C：无水乙醇；流速：0.50 mL/min，进样量：5 µL，柱温：30 ℃，检测波长：220 nm。

②标准曲线的建立

精密称取苦参碱标准品20mg、氧化苦参碱标准品50mg，精密称定，加乙腈-无水乙醇（80：20）混合溶液，定容至50mL容量瓶中，作为标准品溶液（苦参碱：0.2mg·mL^-1、0.5mg·mL^-1）。分别移取标准品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL置于25 mL容量瓶中，乙腈-无水乙醇（80：20）混合溶液定容，用0.45 µm滤膜过滤备用；按2.2.2中的色谱条件进行检测标准品含量测定。以质量浓度（c，µg·mL^-1）为横坐标，以峰面积（x）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

③试样含量测定

准确称取苦参提取物25 mg，乙腈-无水乙醇（80：20）混合溶液定容100 mL，按2.2.2中的色谱条件进行检测，回归方程求得苦参碱及氧化苦参碱含量；并计算各自含量（y，mg/g）。

式中：y—苦参碱及氧化苦参碱得率，mg/g；c—苦参碱或氧化苦参碱的质量浓度，µg·mL^-1；v—提取液体积，mL；n—稀释倍数；m—苦参提取物质量，g。

2.3体外生化试验

2.3.1 酪氨酸酶抑制试验

皮肤色素的形成是由于表皮中黑色素的积累造成的^[7]，黑色素合成过量，会造成皮肤色素沉积，形成色斑，导致肌肤黯沉。一般情况下，酪氨酸酶活性越高，黑色素合成越多。可通过抑制酪氨酸酶活性，来控制黑色素的合成速率^[8]。通过酪氨酸酶活性抑制率，评估物质应用于化妆品中的美白功效，实验反应体系如表1所示。

按照表1的顺序，加样结束后，在25℃下孵育30min，在475nm处测定吸光值。

表1 酪氨酸酶反应体系